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    公开号:WO1991011455A1
    申请号:PCT/JP1991/000086
    申请日:1991-01-28
    公开日:1991-08-08
    发明作者:Yuichi Hashimoto；Koici Shudo
    申请人:Yuichi Hashimoto；Koici Shudo；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] . 明 細 書
    [0002] フオルボールエステル受容体
    [0003] 技術分野
    [0004] 本発明は、 フオルボールエステル（phorbol esters)のような発が んプロモーターの受容体として有用な結合蛋白質に関する。 本発明 による受容体は、 例えば、 究がんプロモータ一や医薬の基礎 ·応用 研究に有用であり、 臨床的に癌の治療 ·診断に有効に利用でき、 さ らに、 この蛋白に対する抗体、 特にモノクロナール抗体の製造に利 用できる。
    [0005] 背景技術
    [0006] フオルボールエステルのうち、 特にテ卜ラデカノィル · フオル ボール一 1 3—アセテー ト (以下 T P.Aという） は、 効果の確認さ れた発がん促進物質 （ブ ϋモーター） であ^、 このほかにも類似の 促進物質が知られている （後記の表参照) 。 この明細書において、 これを総称してフォルポール ステルという。 従来、 フォルボーェ ステルの作用に関与する'受容体は、 カルシウム依存性蛋白質リン酸 化酵素 （protein kinase C. 以下' P K Cという） であるとされてき た。 フォルポールエステルと I5 Κ έとの関係はブルムバーグにより 報告され [シーア一ルシー クリ'チカル * レビュー . 卜キシコ口 ジー； (Blumberg ： CRC Critical Rev. Toxicol. 9, 153-197. 1981： キャンサー . リサーチ-: Ceincer Res. , 1-8, 1988 ) ] ま た核への T P Aの結合に関し ば'ペレラ （Perrella) らにより報告 されている （キャンサー - リサーチ： Cancer Research 42, 3496- 3501. 1982) 。 しかじ、 ： P K ^の介在のみによってフオルボールェ ステル等の発がんプロ ΐ一ターの作用を説明することはできない。 たとえば、 P K Cの活性化 よつても、 がん発生が進むものでな く、 ま P K C活性 0姐害が^ん発生を抑えるものでもない。 従つ て P K Cの他に、 発がんプロ 一ターの探索や癌の治療 ·診断に有 効に利用できる受容体が存在するのではないかという疑問があつ た。 本発明者は、 この問題の解決を目的として、 フオルボールエス テルの作用の発現に決定的に関与する受容体の探索を行なった。 本発明は、 [3 H ] 放射標識された T P Aを用いることによって、 従来から主張されていた P K Cとは異なり、 また P K Cの酵素活性 をもたない、 フオルボールエステル受容体として作用する結合蛋白 質を同定することができるという知見に基ずくものである。
    [0007] 発明の関示
    [0008] 本発明の目的は、 新規のフオルボールエステル受容体として作用 する結合蛋白質を提供することにある。
    [0009] 本発明は、 フオルボールエステル受容体を含有するヒ卜、 哺乳動 物または徼生物の生きた細胞を破壊し、 生理学的に許容し得る塩類 の溶液に懸濁して、 細胞質の可溶性蛋白質含む分画と核の可溶性蛋 白質を含む分画とを集め、 これをクロマトグラフィーに付し、 フォ ルボールエステルと結合する能力を有するが、 力ルシゥム依存性蛋 白質リン酸化酵素と同様の酵素活性を待たない分画を回収する工程 からなる、 フオルボールエステル受容体の製法およびこの製法によ り得られたフオルボールエステル受容体を提供する。
    [0010] 本発明による受容体は、 フォルポールエステルの存在下におい て、 生きた細胞の細胞質から核に移行する能力を持ち、 T P Aと親 和性をもち、 フオルボール ' ジブチレ一卜、 テレオシジン及びアブ リシァトキシンと競合的に結合する能力を持つが、 オカダ酸と結合 しない性質を持ち、 P K Cの酵素活性をもたない点において、 明ら かに P K Cと異なる。
    [0011] 本発明の方法によって得られたフォルポールエステル受容体と放 射性同位体によって標識されたフオルボールエステルとの結合を被 検物質の存在下において測定することによって得られた結果を、 被 検物質の不存在下になされた対応する結果と比較することによつ て、 任意の被検物質のフオルボールエステル受容体との結合性を測 定することができる。 図面の簡単な説明
    [0012] 第 1図は、 HL-60 細胞分画の MonoQ HPLC による分析結果を示 す。 Hい 60 細胞を核分画及 細胞質分画に分け、 各々を Mono Q HPLCにより分析した時のパタ ンである。
    [0013] 図 1 一 U ： ΟΟ280ηΠι でモユタ—した ¾の。
    [0014] 図 1 一 C ： 細胞質分画
    [0015] ■ ■ ： [3H] T P Aのみとインキュベートして測 定した結合量。
    [0016] O 0 ： [3H]-T P Aと 20Q 倍量の T P A共存下で インギュベー卜して測定した非特異的結合 量。
    [0017] ： P K C活性を32 P— A T Pの取り込み量で 示したもの。
    [0018] 図 1 一 N ： 核分画
    [0019] ブロヅ 卜は 1 一 Cに同じ。
    [0020] 第 2図は、 T P Aで処理した HL-60 細胞分画の Mono Q HPLCによ る分析を示す。 Hい 60 細胞を T P Aで 3時間処理した後に第 1図と 同様に分析した。
    [0021] 図 2— C ： 図 1一 Cに対応。
    [0022] 図 2— N ： 図 1 一 Nに対応。
    [0023] 発明を実施するための最良の 態
    [0024] 本発明の受容体 （レセプ夕一） は、 ヒ 卜の細胞から回収される。 ここにヒ 卜の細胞とは、 実用的には、 人体の組織から分離した正常 細胞や Hい 60細胞や Hela 細 のような株化細胞であるが、 所望に より、 本発明の受容体を含有する限り、 例えば、 ネズミ、 ゥサギ等 の哺乳動物や大腸菌の等の微生物細胞を用いることもできる。 これ らの細胞の採集及び培養法は.窜法によることができる。 培養された 細胞を、 そのままで、 または、. 例えば、 '遠心処理 （ 1000 r.p.m./ 5- 20分） によって集め、 低温、 例えば 4 Cで P B S (pH 7-9)で洗浄
    [0025] し、 生理学的に'許容'ざれる塩， 例えば、 食塩（5-10 mM) を含む緩衝
    [0026] 液等の水溶液に懸濁 （例えば 5-10分間） し、 例えば、 低圧刺激によ
    [0027] り破壊した後に、 遠心処理 （ 3000f. p.ra./ 5-20分） によって核成分
    [0028] (ペレツ 卜） を分離し、 上澄を超遠心 （例えば、 10000 G/1時間）
    [0029] して可溶性の細胞質分画を得る。 核成分を同様な緩衝液、 例えば、
    [0030] 0.6MKC1-10 mM 卜 リ ス緩衝液（pH 7 -9 )で均質化し、 超遠心処理
    [0031] ( 10000 G/1時間） して可溶性の核分画を得る。 各分画を限外濾過
    [0032] して、 分子量 lOkDa 以上の部分を除き、 次に同様の緩衝液を用いる
    [0033] イオン交換クロマトグラフィー、 ゲルクロマトグラフィー、 ァフィ
    [0034] 二テイ クロマ卜グラフィ一など液体クロマ卜グラフィ一等によつて
    [0035] 所望の結合蛋白質を回収する。
    [0036] 本発明による受容体の存在を、 例えば、 卜 リチウム標識された
    [0037] T P Aの存在下及び不存在下において、 [3H] 標識された T P Aと
    [0038] の各分画の蛋白質の結合性を基準として調べることができる。 これ
    [0039] によって同時に各分画の P K C活性も測定する。 さらに分画の相対
    [0040] 的流出部位の決定を容易にするため、 流出に伴なう紫外部 （280nm)
    [0041] の吸光度の変化を記録する。
    [0042] このようにして、 P C K活性を有さずに T P Aと強く結合する本
    [0043] 発明による受容体の回収条件を決定することができる。
    [0044] T P Aが存在しない培地で培養した細胞を用いた場合、 陰ィオン
    [0045] クロマトグラフィーによって、 核分画のは、 本発明による受容体の
    [0046] 分離は認められない （図 1一 N) 。 しかし細胞の可溶性蛋白質を細
    [0047] 胞から分離した場合、 目的産物を検知することができる。 例えば、
    [0048] 陰イオンク ロマ トグラフィーにおいて、 保持時間 58— 60分に
    [0049] P K C活性を持たないけれども、 T P Aと結合する物質の流出を認
    [0050] めるこどができた （図 1一 C) 。 本発明による受容体と P K Cとの ¾5 違.いは明らかある。 すなわち P K Cは、 第 1図 1一 Cにおいて、 保
    [0051] 持時間 26— 44分に流出する点が異なるほか、 分画の P K C活性の測 定によって明確に区別できる。 一般に保持時間はクロマ 卜グラ フィ一の条件によって異なる έ
    [0052] 以上のとお り 、 本発明による受容体を T P A との結合性.、 P K C活性試験及びクロマ卜グラフィーの保持時間、 T P A以外の 発がんプロモーターとの結合性、 核への 移行性の有無の一種以上を 基準として同定し、 回収する とができるが、 実用的手法として、 クロマ卜グラフィ一における流出時期と紫外線吸収との単独または 組合わせによって同定すればよ 、。 一度;同定されれば、 本発明によ る受容体を選択的に回収する とは容易である。
    [0053] 本発明による受容体と T P Aとの結合定数は、 10 l QM_ 1 で非常に 大きい （スキャッチヤードの分析法による） 。 また本発明による受 容体は、 T P A以外のフオルボールエステル （フオルボールジブチ レー卜など） ' T P Aと類似の作用機構をもっとされているテレ才 シジン類、 アブリシァ卜キシン類 （これらをフオルボールエステル 型発がんプロモーターと称する） とも強ぐ'結合する。 一方、 T P A と作用機構の異なるとされている発がんプロモーターであるオカダ 酸とは結合しない。
    [0054] 本発明による受容体は p κ eの酵素活性をもたない。 また、 この 受容体は細胞質に存在するが、 Τ P A ©存在下で培養すると例えば 3時間以内に細胞質から核へと移行する性質をもっている。 この性 質は、 T P Aで処理した插胞と処理しナ I /、細胞とを各々細胞質と核 に分離した後、 それぞれを抽 i ，分離を行なって確かめられる。 下記の非限定的実施例および試験例 より、 本発明を説明する。 そこでは、 フオルボールエステルとして T P Aを用い、 10°C以下で 処理した。
    [0055] 実施例 1 '
    [0056] HL-60 細胞 （HeLaヘラ細胞を用いる場合も同じ操作） をゥシ胎児 血清（5¾V/v) を含む R P M I — 1 ·6 4 0培地 （ 1000 ml ) を用い， 37 Όで 48時間培養し、 遠心処理 （ 1000 r.p.ni. 5分） で細胞を 集め、 細胞 （湿重量 1.0 g) を氷冷 P B Sで洗い、 7.5 mM食塩水 (5m'l) に再懸濁し、 1 5分間水冷後、 低張刺激によって細胞を破壊 した。 破壊された細胞を含む懸濁液を遠心処理 （3000 r.p.m. 5分 間） して、 上澄と核分画とを分離した。
    [0057] 上澄を遠心分離 （100000 G、 1時間） し、 可溶性分画 （細胞質分 画） を得た。 核分画を 0. KCl-20mM 卜 リス緩衝液 （pH 8.0) でホ モゲナイズし、 遠心分離 （ 100000 G 1時間） して、 可溶性核分画 を得た。 各分画を、 限外濾過 （力 卜オフ分子量 1 0 k D ) 後、 次 の条件の高速液体クロマトグラフィーに付した （図 1参照） 。
    [0058] 陰ィォン交換力ラム （フアルマシァ社製、 Mono Q HR5/5) を用 い、 20mM卜リス緩衝液 （pH 8.0) に 20mM— 1 M の NaCl を加えたも ので， 流速 5 ml/ 分で流出した。 Nacl 濃度は 15mM Nacl/1分の割 合で増加させた。 図 1一 Uに、 保持時間 （横軸） と 280 nmで検出し た紫外部吸収強度とを示す。 各分画の T P Aとの結合活性の測定は 次のように行なった。
    [0059] 液体クロマ卜グラフィ一で流出する各分画のフオルボールエステ ル結合活性の検出は、 ニトロセルロースを用いるフィルター結合試 験によった。 各分画は 1 0 nMの [3H ]-T P A (12.7 Ci/mmole, NEN 社） とともに、 T P Aの不在下、 あるいは 2 00倍モルの T P Aの 存在下に 4°C、 16時間インキュベートする。 これをニトロセルロー ス膜を通し P B Sと 20%エタノールで洗浄後、 液体シンチレーショ ン測定器で放射活性を測定した。
    [0060] 測定された T P Aの結合活性を示す図 1 一 Cにおいて、 実線 ■ ■ は [3H]-T P Aのみとともにインキュベートして測 定したときの [3H]-T P Aの結合量を示し、 点線 ◊ O は
    [0061] [3H]-T P Aに 20Q 倍量の T P Aの共存下でィンキュベー卜して測 定したときの非特異的結合量を示す。 このように、 保持時間 26— 44分と保持時間 58— 60分 （矢印） に特異的な結合が認められた。 こうして確認された T P Ai 合成分のうち、 P K Cは、 各々の分 画の P K C活性の測定によって区別できる。 この酵素活性の測定は P K C活性測定キッ ト 〔ァ ャム （Amersham)社製] を用いて行 なった。 その結果、 第 1図 1 Cに点線によって示すように、 保持 時間 2 6— 44分に流出する分画はリン酸化活性を示し、 P K Cで あることがわかり、 保持特間.58— 60分に流出する P K C酸化活性を 示さない分画が、 核移行性のブオルポールエステルレセプターを含 むものであることがわかった。
    [0062] また、 上記核分画について 同様の処理を行なったクロマ卜グラ フィー （図 1 一 N) に示すように、 核移行性のタンパク質は核には 存在しない。
    [0063] 実施例 2
    [0064] 4πΜの T P Aを含む培地に 37で、 3時間培養した HL-6Q 細胞を、 実施例 1 と同様に細胞質分画と核分画に分離した。 1 g 湿重量に相 当する細胞から得た核分画¾,0.6 M KC1 -20mM卜 リス緩衝液中でホ モゲナイズし、 遠心分離 （10Q000 G、 1時間） し、 上澄 （可溶性核 分画） を得た。 この分画を実旆例 1に示すと同様の液体クロマ卜グ ラフィーによって分画し、 実施例 1に示すと同様に T P A結合性と P K C活性とを測定した （図 2— N) 。 そうして保持時間 58— 60分 に P K C活性を持たないが、 Ί; P Aに結合するフオルボールエステ ル受容体を得た。 T P A存在下に培養した細胞の細胞質には、 T P Aに結合し P K C活性を持たない蛋白質は認められなかった (図 2 - C) 。
    [0065] 試験例 1
    [0066] 実施例 1記載の細胞質分画のクロマ卜グラフィ一によつて得られ る本発明のフオルボールエステル受容体 （図 1 一 Cの矢印部分） を 濃度 0.01 M - 1 nM.の [3 Η]-ΤΡ Αと 2時間 4。Cでインキュべ— 卜 した後の [3H]-T P Aとの結合を、 実施例 1記載の方法で調べ、 非 結合 [3H]-T P Aの濃度を測定した。 スキャッチヤードの分析法に よる結合定数は 1-2 X 1010M _1であった。
    [0067] 試験例 2
    [0068] 本発明のフオルボールエステル受容体の T P A以外のフオルボー ルエステル関連物質との結合性を、 [3H ]-T P Aと本発明の受容体 との結合の阻害の程度によって表した。 この阻害の程度を次のよう に測定した。 実施例 1で得た本発明のフオルボールエステル受容体 を、 それぞれ、 4 nMの [3H ] -T P A及び 20Q ないし 1000倍量の T P Aまたは次表に示した関連物質とともに 4 Cで 16時間インキュ ベー卜 し、 実施例 1の場合と同様に、 二卜ロセルローズ ' フィル ターを用いて [3 H ] T P Aとの結合を調べた。 次表において、 200 倍量の T P A存在下における値を 10ϋ %とした。 試料 倍量 ΤΡΑ 結合阻害率 （％)
    [0069] 4H - 0
    [0070] T P A 200 100
    [0071] フオルボール · ジブチレ一卜 200 83
    [0072] テレオシジン . B— 200 104
    [0073] オリポレチン C 200 1
    [0074] 同 1000 8
    [0075] オカダ酸 200 一 6
    [0076] 同 1000 -6
    [0077] デブロムアブリシァ卜キシン 200 99
    [0078] 新だ
    权利要求:
    Claims
    請 求 の 範 囲
    1 ) フオルボールエステル ¾寒体を含有 るヒ 卜の生細胞、 哺乳動 物の生細胞または微生物の生 iteを破壊 、 生理竽 に許容し得る 塩類の水溶液に懸濁して、 細胞質の可溶性蛋白質を含む分画と核の 可溶性蛋白質を含む分画とを集め、 これをクロマトグラフィーに付 し、 フオルボールエステルと結合する靡力を有するが、 カルシウム 依存性蛋白質リン酸化酵素の酵素活性 もたない分画を回収するェ 程からなる、 フオルボー J¾ f レ受容体の製法。
    2 ) ヒ 卜の細胞が正常細胞、 1£-60 紙)^またはヘラ細胞である請求 の範囲第 1項記載の方法。
    3 ) クロマ卜グラフィ一が陰イオンクロマ卜グラフィ一である請求 の範囲第 1項又は第 2項記載の方法。
    4 ) クロマ トグラフィー おいて、 放射性物質を用いて標識した フオルボールエステルを用い ,、：フオルボールエステルと結合する 能力を有するが、 カルシウム依存性蛋白質リン酸化酵素と同様の酵 素活性をもたない分画を同定することにより、 所望の分画を回収す る請求の範囲第 1項から第 3項ま のいずれかに記載の方法。
    5 ) フオルボールエステルの存在下に紫外線吸収によって、 フオル ボールエステルと結合する能 ¾を有するが、 カルシウム依存性蛋白 質リン酸化酵素と同様の酵素活性をもたない分画を同定することに より、 所望の分画を回収する請求の範囲第 1項から第 4項までのい ずれかに記載の方法。
    6 ) 請求の範囲第 1項から第 5項までのいずれかに記載の方法によ つて得られたフォルボールエステル受容体。
    7 ) フオルボールエステルの存在下に、 生きた細胞の細胞質から核 に移行する能力を持つ請求の範囲第 6項記觳のフオルボールエステ ル受容体。
    8 ) 1 2— G—テ卜ラデカノィルーフオルボール一 1 3 -ァセテー 卜 と親和性をもち、 フオルボール ' ジブチレ一卜、 テレオシジン、六
    新 な用紙 リポレチン及びアプリシァ卜キシンと競合的に結合する能力を持つ が、 オカダ酸と結合しない請求の範囲第 6項又は第 7項記載のフォ ルポールエステル受容体。
    9 ) 請求の範囲第 1項から第 5項までのいずれかに記載の方法に よって得られたフオルボールエステル受容体ど放射性同位体によつ て標識されたフオルボールエステルとの結合を被検物質の存在下に おいて測定した結果を、 被検物質の不存在下に得られた対応する測 定結果と比較する工程からなる、 被検物質のフオルボールエステル 受容体との結合性の測定法。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1991-08-08| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): JP US |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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